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Aug 28, 2023

Lösungsstruktur von rekombinantem Pvfp

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 5, Artikelnummer: 739 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Einige Meeresorganismen können wässrigen Gezeitenumgebungen widerstehen und fest an nassen Oberflächen haften. Dieses Verhalten hat zunehmende Aufmerksamkeit für potenzielle Anwendungen in der Medizin, bei Biomaterialien und im Tissue Engineering geweckt. Bei Muscheln sind die Adhäsionskräfte am Gestein das Ergebnis proteinhaltiger Faserformationen, die Byssus genannt werden. Wir präsentieren die Lösungsstruktur von Pvfp-5β, einem der drei byssalen Plaqueproteine, die von der Asiatischen Grünen Muschel Perna viridis abgesondert werden, und der Komponente, die für die Auslösung von Wechselwirkungen mit dem Substrat verantwortlich ist. Wir zeigen, dass Pvfp-5β eine stabil gefaltete Struktur aufweist, die mit dem Vorhandensein von zwei EGF-Motiven in der Sequenz übereinstimmt. Die Struktur ist bis auf einige wenige Reste, die durch langsame lokale Bewegungen im µs-ms-Zeitmaßstab beeinflusst werden, sehr starr und weicht von dem Modell ab, das mit Methoden der künstlichen Intelligenz für die relative Ausrichtung der EGF-Module berechnet wurde, wo rechnerische Methoden immer noch unterdurchschnittlich sind . Wir zeigen auch, dass Pvfp-5β auch ohne DOPA-Modifikation zur Koazervierung in der Lage ist, was sowohl Erkenntnisse zum Verständnis des Adhäsionsmechanismus von adhäsiven Muschelproteinen als auch zur Entwicklung von Biomaterialien liefert.

Wie es Meeresorganismen wie Muscheln, Seesternen und Sandburgwürmern gelingt, so fest an nassen Oberflächen zu haften, dass sie der Stärke von Gezeiten und stürmischen Wellen standhalten, ist ein Thema von zunehmendem Interesse1. Dies liegt nicht nur an der Bedeutung dieser Eigenschaft für die Schifffahrtsindustrie, für die Oberflächenbiofouling ein großes Problem darstellt, da es die Oberflächenkorrosion beschleunigt, die eine kostspielige Oberflächenwartung erfordert. Noch interessanter sind die Auswirkungen, die ein umfassendes Verständnis eines derart festen Adhäsionsmechanismus für die Entwicklung neuer Biomaterialien mit Eigenschaften haben könnte, die in der regenerativen Medizin, im Tissue Engineering und in der Materialwissenschaft genutzt werden könnten2,3.

Zu den Meeresorganismen mit Adhäsionseigenschaften gehören Muscheln, die eine Strategie für eine starke Unterwasseradhäsion durch die Sekretion eines proteinbasierten, fadenförmigen Anhängsels namens Byssus entwickelt haben. Dieses besteht aus Filamenten, die aus miteinander verflochtenen Faserbündeln bestehen4. Jedes Filament endet mit einer proteinreichen Plakette, die die Muschelfußproteine ​​(Mfps) enthält, die sich durch Klebeeigenschaften auszeichnen, die als wasserbeständiger Kleber wirken und es der Faser ermöglichen, sich fest auf verschiedenen Substraten zu verankern5,6. Chemisch gesehen besteht die Byssus-Zusammensetzung aus mehreren verschiedenen Proteinen, die alle im Muschelfuß synthetisiert werden, einem großen Organ, das es der Muschel im Süßwasser ermöglicht, durch das Substrat zu ziehen und sich fortzubewegen. Byssus wird in einer Rille auf der Unterseite des Fußes produziert und als zähes Sekret ausgeschieden, das bei Kontakt mit Wasser allmählich aushärtet und Fasern bildet, in einem Koazervationsprozess, der Analogien zur Bildung der Amyloidfasern von Abeta-Peptiden aufweist7.

Sechs Muschelfußproteine ​​wurden in der am meisten untersuchten Mytilus-Gattung identifiziert (mfp-2, -3S, -3F, -4, -5 und -6)8. Proteine ​​aus diesem Organismus haben schwache Adhäsionsenergien (<5 mN/m) und die Besonderheit, biologisch abbaubar und damit umweltfreundlich9, in der Regel ungiftig und mit geringen Immunantworteigenschaften10 zu sein. Eine Besonderheit der Muschelfußproteine ​​besteht darin, dass sie die katecholische Aminosäure 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanin (DOPA) enthalten, ein Derivat von Tyrosin, das durch posttranslationale Modifikation gewonnen wird11. Es ist bekannt, dass DOPA durch seine Fähigkeit, Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen, Metallkoordination und kovalente Bindungen zu bilden, an eine Vielzahl von Substraten bindet12,13,14,15,16, weshalb sich viele Studien bisher auf von DOPA abgeleitete Polymere konzentrierten Entwicklung neuer adhäsiver Biomaterialien.

In einer früheren Studie haben wir die nicht DOPA-modifizierte Version eines der MFP-Proteine ​​​​aus der asiatischen Grünmuschel Perna viridis (Pvfp-5β) charakterisiert17. Unter den von diesem Organismus produzierten Proteinen, zu denen auch Pvfp-3α und Pvfp-6 gehören, ist Pvfp-5β das erste, das sezerniert wird und eine Wechselwirkung mit dem Substrat herstellt, was es zu einem System von besonderem Interesse macht18. Die Sequenz dieses Proteins enthält zwei Tandem-Wiederholungen mit hoher Homologie zu EGF-Modulen und teilt 47–50 % Identität mit den EGF-Wiederholungen des Notch-Ligand-Δ-like-1-Proteins17,18. EGF-Motive sind All-β-Proteine, die durch drei konservierte Disulfidbrücken gekennzeichnet sind, die Calciumionen verbinden können, und sie wurden auch in anderen Muschel-adhäsiven Proteinen beobachtet, wie etwa Mgfp-2 von Mytilus galloprovincialis12,19,20. Wir haben gezeigt, dass es möglich ist, rekombinantes Pvfp-5β in Bakterien zu produzieren und dass Pvfp-5β auch in Abwesenheit von DOPA-Modifikationen eine geringe Toxizität und intrinsische Klebeeigenschaften aufweist17, was die Möglichkeit eröffnet, dieses Protein als Oberflächenbeschichtungs-Biomaterial für zu verwenden medizinische Anwendungen einschließlich der Regeneration von geschädigtem Gewebe. Diese Ergebnisse wurden auch durch andere Studien gestützt, die zeigten, dass DOPA-substituierte Reste nicht notwendig sind, um eine starke nassbeständige Haftung zu erzeugen, und DOPAminierte Proteine ​​haben keine besseren Klebeeigenschaften als die entsprechenden nicht-DOPAminierten Versionen5,21. 22. Unsere Ergebnisse stimmen auch mit jüngsten Studien überein, die die Bedeutung von Lysinresten (Lys) für die Muscheladhäsion23,24,25,26 hervorgehoben haben. Tatsächlich neigen sowohl DOPA als auch Tyrosin dazu, Kation-π-Bindungen mit flankierenden positiv geladenen Resten wie Lysin zu bilden, was vermutlich die Kohäsionsstärke adsorbierter Mfps-Schichten erhöht und eine spontane Flüssig-Flüssig-Phasentrennung eines proteinreichen Proteins induziert flüssige Phase (komplexe Koazervation) in salzigen Lösungen27,28,29.

Kürzlich zeigte eine andere Studie, dass sowohl das DOPA-modifizierte als auch das nicht-modifizierte Pvfp-5β weitgehend unstrukturiert sind und dass nur das DOPA-modifizierte Pvfp-5β unter meerwasserähnlichen Bedingungen eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) aufwies, während das Die reine Tyr-Version bildet nur unlösliche Aggregate30. Diese Ergebnisse werfen im Widerspruch zu unseren Daten zwei wichtige Fragen auf: Wenn die Proteine ​​unstrukturiert wären, warum hat die Natur die EGF-Faltung verwendet, die bekanntermaßen auch dank der Disulfidbrücken stabil gefaltet ist? Ist DOPA das einzige Paradigma für die Entwicklung neuer, von Muscheln inspirierter Bioadhäsive?

Um diese Fragen zu untersuchen, haben wir einen weiteren wichtigen Schritt hin zu einem Verständnis der strukturellen Determinanten der Klebeeigenschaften von Pvfp-5β gemacht, indem wir seine dreidimensionale Struktur in Lösung gelöst und festgestellt haben, dass die Struktur trotz des Fehlens eines geeigneten hydrophoben Kerns erhalten bleibt in Lösung ist relativ starr und weist nur lokale langsame Bewegungen auf. Wir beweisen auch experimentell, dass unmodifiziertes Pvfp-5β eine einfache Koazervation bei neutralem oder basischem pH-Wert durchlaufen kann, und stellen den Koazervationsprozess dar, der durch die Selbstorganisation von Pvfp-5β durch molekulares Andocken verursacht wird.

Unsere Ergebnisse liefern die Grundlage für ein besseres Verständnis der strukturellen Determinanten der Adhäsionseigenschaften von Muschelproteinen.

Unser zuvor veröffentlichtes 2D-1H-15N-HSQC-NMR-Spektrum von unmodifiziertem Pvfp-5β lässt wenig Zweifel daran aufkommen, dass das Protein stabil gefaltet und monomer ist und eine Peakdispersion über einen Bereich von 9,7–6,7 ppm aufweist (ergänzende Abbildung S1)17. Anschließend beschlossen wir, mit der Bestimmung der dreidimensionalen NMR-Struktur in Lösung von Pvfp-5β fortzufahren. Bemerkenswert ist, dass sich das HSQC-Spektrum unseres rekombinanten Pvfp-5β deutlich von dem kürzlich von einer anderen Gruppe veröffentlichten unterscheidet, was mit einem größtenteils unstrukturierten Protein übereinstimmt30. Die Bestimmung der dreidimensionalen NMR-Struktur in Lösung von Pvfp-5β war trotz der geringen Größe des Proteins keine leichte Aufgabe. Dies liegt daran, dass die Zuordnung der NMR-Spektren aufgrund des hohen Gehalts an Tyrosinen (20,5 %) und Prolinen (9,6 %) einen enormen Aufwand erforderte. Dennoch konnte eine nahezu vollständige Zuordnung erreicht werden (ergänzende Abbildung S1), und mit Ausnahme von Pro12 wurden fast alle Seitenketten der Pvfp-5β-Aminosäurereste erfolgreich zugeordnet. Die Aufgabe wurde der BMRB-Datenbank unter der Zugangsnummer 51091 übermittelt.

Interessanterweise stellten wir fest, dass die chemischen Verschiebungen der zwölf Cysteine ​​alle Werte aufweisen, die mit ihren oxidierten Formen kompatibel sind (Ergänzungstabelle 1), im Gegensatz zu unserer vorherigen Bestimmung der Disulfidbrücken durch Massenspektrometrie, die die Bildung von nur fünf der sechs bestätigt hatte Mögliche Brücken17. Wir haben jedoch festgestellt, dass einige Resonanzen von Resten entlang der gesamten Kette recht große Abweichungen von den erwarteten Werten aufweisen. Aus Vorsichtsgründen haben wir daher zunächst ARIA-Berechnungen durchgeführt, bei denen nur die fünf von MS gefundenen Disulfidbindungen berücksichtigt wurden: C13–C29, C31–C40, C45–C56, C50–C67 und C69–C7817. Die resultierenden energetisch besten 20 Strukturen hatten eine quadratische mittlere Abweichung (RMSD) des Rückgrats von 1,43 +/– 0,39 Å unter Berücksichtigung aller Reste und von 1,17 +/– 0,25 Å unter Berücksichtigung nur der an geordneten Trakten beteiligten Reste (3–4, 6). , 8–34 36–38, 41–59 und 61–82). Im endgültigen Strukturensemble waren acht Verstöße gegen die Abstandsbeschränkungen über 0, 5 Å sowie eine schlechte Überlappung für die Traics 1–11 und 18–30 erkennbar (ergänzende Abbildung S2).

Die Gesamtstruktur von Pvfp-5β stimmt mit den Erwartungen aus Homologiekriterien überein und zeigt das Vorhandensein von zwei Tandem-EGF-Modulen, die aus zwei lösungsmittelexponierten antiparallelen β-Faltblättern und zufälligen Knäuelregionen bestehen, die durch die Disulfidbrücken zusammengehalten werden (ergänzende Abbildung S2). ). Das erste Modul enthält nur zwei der drei Disulfidbrücken, die für eine EGF-ähnliche Domäne erwartet werden (C13–C29, C31–C40), während das zweite Modul wie erwartet drei Disulfidbrücken enthält (C45–C56, C50–C67 und C69– C78). Der verbleibende Teil der Struktur ist durch lange Zufallsspulenbereiche gekennzeichnet. Diese vorläufigen Ergebnisse bestätigen und erweitern frühere Vorhersagen und beweisen zweifelsfrei, dass das Protein gefaltet und strukturiert ist.

Um die dynamischen Eigenschaften des Proteins und damit das Vorhandensein der sechsten Disulfidbrücke zu untersuchen, haben wir die Proteinrelaxation auf der ps-ns-Zeitskala untersucht. Obwohl Pvfp-5β nur wenige Sekundärstrukturelemente enthält, deuten die Relaxationsdaten auf ein relativ starres Protein hin, wie die einheitlichen Werte von 15N-R1, 15N-R2 und hetNOE bei 14,1 und 18,8 T zeigen (Abb. 1). Erhöhte 15N-R2-Werte zusammen mit niedrigen R1- und relativ hohen HetNOE-Werten wurden für die Reste C8, N39, Y42, C45, G72, Q77 und Q79, die alle zu unstrukturierten Regionen und/oder Schleifen gehören, sowie für die Reste T18 und Y27 beobachtet zu β1 bzw. β2. Dies deutet darauf hin, dass es für diese Reste keine schnellen lokalen Bewegungen innerhalb der μs-ms-Zeitskala gibt.

15N-R1, 15N-R2, hetNOE und R2/R1-Verhältnis bei 298 K, gemessen für alle Pvfp-5β-Reste bei 14,1 T (blaue Punkte) und 18,8 T (rote Punkte). β-Stränge sind als blaue Pfeile oben in der Abbildung dargestellt, während gelbe Kurven Disulfidbindungen anzeigen. Schwarze Sternchen zeigen Prolinreste oder Reste mit überlappenden Peaks in den NMR-Experimenten an. In Fettdruck sind Reste dargestellt, die keine schnellen lokalen Bewegungen innerhalb der ms-μs-Skala zeigen.

Um zu bestätigen, dass die beobachteten dynamischen Merkmale dem Protein innewohnen und unabhängig von den experimentellen Bedingungen sind, haben wir Relaxationsexperimente bei verschiedenen Temperaturen (288, 293 und 303 K) bei 18,8 T wiederholt. Die resultierenden hetNOE- und R2/R1-Verhältnisse wurden aufgezeichnet jede Temperatur und zeigte keine Änderungen im allgemeinen Trend (ergänzende Abbildung S3). Für eine zuverlässigere Interpretation der Daten haben wir die Daten auch mit dem Ansatz der reduzierten Spektraldichtekarte analysiert, der ein unvoreingenommenes qualitatives Bild der Proteinbewegungen liefert (ergänzende Abbildung S4). Dieser Analyse zufolge weist Pvfp-5β ein für ein starres Protein typisches Muster auf, wobei nur die Reste 2–4 und 83 als flexibel identifizierbar sind und die Bewegungen des Rückgrat-NH-Vektors kaum eingeschränkt sind. Die Reste C8 und T18 unterliegen einem Konformationsaustausch im μs-ms-Zeitraum, was das Vorhandensein der sechsten Disulfidbrücke zwischen C8 und C19 unterstützt. Wir kamen daher zu dem Schluss, dass unsere früheren MS-Ergebnisse, die sich auf His-markiertes Pvfp-5β bezogen, durch das Vorhandensein des N-terminalen Tags beeinflusst worden sein müssen, was möglicherweise das Redoxpotential des N-terminalen C8-Cysteins beeinflusst hat. Die Reste Y27, N39, G72 und Q77 unterliegen ebenfalls einem Konformationsaustausch auf der μs-ms-Zeitskala, während die Reste N6, G23 und G61 in einer Zwischensituation zwischen flexibel und starr auftraten und immer noch eine schnelle Bewegung in Richtung des niedrigen Werts von J(0) erlebten ).

Aus den T1/T2-Verhältnissen von 27 Resten mit T1- und T2-Werten innerhalb einer Standardabweichungseinheit vom Durchschnitt wurde eine Korrelationszeit von 7,8 ns erhalten. Dieser Wert ist etwas länger als der, der für ein globuläres Monomerprotein von 9,5 KDa erwartet wird, aber dies ist durch die längliche Ellipsoidform von Pvfp-5β gerechtfertigt, was durch das daraus abgeleitete Verhältnis DII/DI (1,3) des Diffusionstensors bestätigt wird Orientierungsabhängigkeit von R2/R1, was auf Anisotropie32 hinweist.

Diese Beobachtungen liefern wertvolle Informationen über die Dynamik des Proteins und lassen uns zu dem Schluss kommen, dass Pvfp-5β bei saurem pH-Wert ein monomeres Protein ist, obwohl es bei neutralem und basischem pH-Wert stark zur Aggregation neigt.

Eine zweite Strukturberechnung wurde durchgeführt, wobei die in unseren dynamischen Studien gefundene zusätzliche Disulfidbrücke C8–C19 eingesetzt wurde. Die energetisch besten 20 Strukturen von Pvfp-5β haben einen RMSD von 1,42 +/– 0,5 Å für die Rückgratatome aller Reste und von 1,09 +/– 0,29 Å nur für die Rückgratatome der geordneten Reste 3–4, 6– 82 (Abb. 2 und Tabelle 1). Das neue Strukturensemble führte zu einem geringeren Grad an Variabilität im langen N-Terminus in Übereinstimmung mit den Relaxationsdaten, zum Verschwinden einiger konsistenter Verstöße und zu einer insgesamt besseren Definition des NMR-Bündels in Übereinstimmung mit dem Relaxationsprofil. Das Vorhandensein der zusätzlichen Disulfidbindung C8–C19 in der Mitte einer N-terminalen Zufallsknäuel erklärt die höheren 15N-R2- und hetNOE-Werte und das Vorhandensein des Austauschbeitrags am Rest C8 sowie die Teilordnung des Trakts 9- 16. Wir können dieses Bündel daher als repräsentative Struktur für Pvfp-5β betrachten. Die Strukturkoordinaten sind in der Proteindatenbank mit dem Zugangscode 7QAB hinterlegt.

eine Überlagerung der 20 niedrigsten Energiestrukturen. b Cartoon-Darstellung der Struktur bei niedrigster Energie mit Disulfidbrücken in Gelb. c Cartoon-Darstellung der Struktur bei niedrigster Energie mit Tyrosinen, Lysinen und Argininen, hervorgehoben in Orange, Blau und Magenta. d Elektrostatisches Oberflächenpotential mit sauren Rückständen in Rot und Basen in Blau. e Hydrophobe Oberfläche.

Wie bei anderen EGF-ähnlichen Proteinen fehlt Pvfp-5β fast vollständig ein hydrophober Kern, was auch durch unsere Analyse der Temperaturkoeffizienten bestätigt wird, die als Verhältnisse dδHN/dT im Bereich von 283–303 K definiert sind (ergänzende Abbildung S5). Bei der Darstellung des länglichen Moleküls entlang der Längsachse ist eine der beiden gegenüberliegenden Oberflächen überwiegend positiv geladen (Abb. 2d). Mischungen aus Tyrosinen und Lysinen sind über das gesamte Protein verteilt (Abb. 2c). Wie erwartet wiesen die meisten Reste in unstrukturierten Regionen und Schleifen einen dδHN/dT < –5 ppb/K auf, was auf lockere H-Bindungen schließen lässt33. Werte von dδHN/dT < –5 ppb/K wurden auch für die Reste K21, Y27, C56 und C67 erhalten, die zu beiden β-Faltblättern gehören und darauf hinweisen, dass diese Reste dem Lösungsmittel ausgesetzt waren. Die Reste T18, K20, R22, S26, K28, Y30, G57, Y64, Y65, K66 und S68, alle in β-Faltblattregionen, zeigten dδHN/dT > –5 ppb/K, was ihre Beteiligung an Sekundärstrukturelementen bestätigt und stabil ist H-Brücken. Werte von dδHN/dT > –5 wurden auch für wenige Reste beobachtet, die sich in Kehrtwendungen zwischen β-Faltblättern, in den Schleifen und sowohl in N- als auch in C-Schwänzen befinden, was mit einer insgesamt relativ starren Struktur übereinstimmt (ergänzende Abbildung S5). ).

Als Mittel zur Strukturvalidierung haben wir Pvfp-5β mithilfe künstlicher Intelligenz (KI) mithilfe der RoseTTAFold-Software auf dem Robetta-Server modelliert34,35. Wir haben fünf Modelle mit hohen Vertrauenswerten (0,92) und allen sechs Disulfidbrücken erhalten. Der Vergleich dieser Modelle mit dem endgültigen experimentellen Strukturensemble zeigt nur geringfügige Unterschiede, was die Schnittstelle zwischen den beiden EGF-ähnlichen Modulen betrifft, die aufgrund eines Unterschieds in der Schleife β3-β4 geringfügig unterschiedlich ist (ergänzende Abbildung S6). Die NMR-Experimentstruktur wird jedoch direkt durch eindeutige NOEs zwischen den beiden Wiederholungen gestützt und liefert einen Grad an Details, der aufgrund der Natur maschineller Lerntechniken kaum zu erwarten ist. Trotz der enormen Fähigkeit der künstlichen Intelligenz, Strukturen vorherzusagen, kann es dennoch Details geben, die noch nicht vorhersehbar sind.

In einer früheren Studie haben wir durch dynamische Lichtstreuung (DLS) gezeigt, dass Pvfp-5β unter pH-Schockbedingungen zur Aggregation neigt17. In der vorliegenden Arbeit haben wir den Selbstorganisationsprozess von Pvfp-5β durch den Fluoreszenzfarbstoff ThioflavinT (ThT) analysiert, der empfindlich auf die Bildung intermolekularer β-Strukturen in Amyloidfibrillen36 reagiert und sich in Koazervaten37,38 anreichert. Die ThT-Fluoreszenz wurde sowohl durch konfokale Mikroskopie als auch durch Fluoreszenzlebensdauer-Bildmikroskopie (FLIM) überwacht, um die verschiedenen Spezies zu erkennen, die nach der Exposition von Pvfp-5β-Monomeren bei unterschiedlichen pH-Werten gebildet wurden.

Die Einwirkung von Pvfp-5β auf eine alkalische Umgebung (0,1 M Tris-HCl pH 8, 1 M NaCl) führt zum fortschreitenden Auftreten von drei Hauptproteinarten. Kurz nach der Beleidigung wird ein plötzliches Auftreten von Koazervationströpfchen mit einem Durchmesser von etwa 1 μm oder weniger beobachtet (Ergänzungsabbildung S7a, Zusatzfilm). Die Überwachung der Probe über einen Zeitraum von 2 Stunden zeigt die Bildung zunehmend größerer ThT-positiver Spezies mit dem endgültigen Auftreten fibrillärer Strukturen (ergänzende Abbildung S7b, c). Als Kontrolle führt die Inkubation von Pvfp-5β bei pH 4,5 zu keiner ThT-positiven Spezies (ergänzende Abbildung S7d).

Um die strukturelle Architektur der Proteinanordnungen im Submikronbereich zu klären und die Entwicklung mikroskopischer Strukturveränderungen zu untersuchen, wurde FLIM zur Analyse der ThT-Fluoreszenzlebensdauer verwendet39. Dies hat eine besondere Empfindlichkeit gegenüber der Polarität der Umgebung, dem Vorhandensein spezifischer Reste (z. B. Aromaten) oder dem Abstand zwischen β-Strängen40. In wässriger Umgebung hat ThT eine Lebensdauer im Pikosekundenbereich, während längere Lebensdauern in Medien mit höherer Viskosität gemessen werden41. FLIM-Messungen wurden unter Verwendung des Phasor-Ansatzes analysiert, der im Abschnitt „Methoden“ detailliert beschrieben wird und einen globalen Überblick über den Zerfall fluoreszierender Moleküle bietet, ohne dass ein spezifisches Modell vorgeschrieben wird, wie es für Anpassungsverfahren erforderlich ist (Abb. 3)42,43. Messungen an ThT-gefärbtem Pvfp-5β in alkalischer Umgebung zeigen drei verschiedene ThT-Fluoreszenzlebensdauerverteilungen, die als unterscheidbare Punktwolken im Zeigerdiagramm (Abb. 3a) identifiziert werden und jeweils einer der drei wichtigsten ThT-positiven Spezies (Tröpfchen von) entsprechen Koazervate, mittelgroße Anordnungen und fibrilläre Arten). Jede ThT-Lebensdauer in der Pvfp-5β-Probe ist durch einen doppelten exponentiellen Zerfall gekennzeichnet, dessen Hauptkomponenten charakteristische Lebensdauern von τ1 = 0,4 ns und τ2 = 2,4 ns aufweisen, die zuvor für ThT-gefärbte Amyloidstrukturen gefunden wurden (Abb. 3a)44. Der schnellste Zerfall wurde weniger spezifischen Bindungsstellen zugeschrieben. In diesen Fällen tritt ThT-Fluoreszenz aufgrund der erhöhten Umgebungsviskosität auf. Langsamere Zerfälle wurden auf eine spezifischere Wechselwirkung zwischen ThT und intermolekularen β-Strukturen zurückgeführt, die der ThT-Bindungsstelle mehr Einschränkungen und weniger Flexibilität verleihen. Für die leicht gebildeten kugelförmigen Proteinkondensate im Mikrometerbereich wurden kürzere Lebensdauern gemessen, was ihre Natur als Koazervatröpfchen offenbart (Abb. 3d). Die ThT-Lebensdauer nimmt bei größeren Spezies zunehmend zu, was bei Strukturen mit fibrillärer Morphologie zu einer längeren Lebensdauer führt, was auf gepackte/dichte intermolekulare β-Strukturen hinweist (Abb. 3e, f). Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass nicht modifiziertes Pvfp-5β LLPS unter meerwasserähnlichen Bedingungen aufweist, im Gegensatz zu einer aktuellen Studie, die zeigt, dass nur das DOPA-modifizierte Pvfp-5β LLPS zeigte, während die nicht modifizierte Version nur unlösliche Aggregate bildet30.

Zeigeranalyse von 256 × 256 Pixeln FLIM-Messungen am ThT-Signal von 1 mg/ml Pvfp-5β in 0,1 M Tris-HCl pH 8, 1 M NaCl. ein Zeigerdiagramm, das aus Bildern der verschiedenen in der Probe vorhandenen Arten erstellt wurde. Die Koordinaten g und s entsprechen Sinus- bzw. 30-Kosinus-Transformationen jedes Punktes im Zeigerdiagramm. Drei unterscheidbare Lebensdauerverteilungen, hervorgehoben durch farbige kreisförmige Cursor, sind erkennbar und liegen auf einer geraden Linie (gestricheltes Gelb), die zwei monoexponentielle Zerfallszeiger mit einer charakteristischen Lebensdauer von 2,4 ns und 0,4 ns verbindet. b, c, d Fluoreszenzintensitätsbilder, von niedriger Intensität (blau) bis hoher Intensität (rot) von Koazervattröpfchen, mittelgroßen Aggregaten bzw. Fibrillen. e, f, g Lebensdauerkarten: Jedes Pixel wird entsprechend dem entsprechenden Farbcode des Cursors eingefärbt, wodurch die Lebensdauerverteilungen im Zeigerdiagramm a) hervorgehoben werden.

Um einen bildlichen Eindruck vom Pvfp-5β-Koazervationsprozess zu erhalten, der bei der Muscheladhäsion abläuft, nutzten wir die experimentelle Struktur von Pvfp-5β, um ein molekulares Andocken des Pvfp-5β/Pvfp-5β-Dimers durchzuführen, um vorherzusagen, welche Oberfläche die Selbstorganisation initiieren könnte . Das Andocken des Dimers durch HADDOCK führte zu drei Clustern, von denen der erste der am dichtesten besiedelte (177 Strukturen) mit dem besten HADDOCK- und Z-Score mit einem Gesamt-RMSD von 0,6 ± 0,3 Å gegenüber der gesamten Struktur mit niedrigerer Energie ist (Ergänzung). Tabelle 2). Die resultierenden Dimere werden Kopf an Schwanz mit einer D2-Symmetrieachse mit einem gut strukturierten hydrophoben Kern angeordnet, an dem Y27, Y62 und Y65 beider Monomere beteiligt sind (Abb. 4). Der Komplex wird durch eine Reihe von π-π- und Kation-π-Wechselwirkungen sowie durch ein ausgedehntes Netz von Wasserstoffbrückenbindungen in der Grenzfläche zwischen den beiden Monomeren stabilisiert (Ergänzungstabelle 3). Ein weiteres Andocken zwischen den Dimeren legt nahe, dass sie durch zusätzliche freiliegende Tyrosine auf der Außenoberfläche des Dimers miteinander interagieren könnten. Dies würde eine Ausrichtung der länglichen Monomerstruktur senkrecht zur Faserachse bedeuten.

Niedrigste Energiestruktur des Pvfp-5β/Pvfp-5β-Dimers, berechnet von HADDOCK. eine Cartoon-Darstellung mit Resten der beiden an der Wechselwirkung beteiligten Komponenten in Stäbchen. b, c elektrostatisches Oberflächenpotential für ein Monomer und Cartoon-Darstellung für das andere.

In dieser Arbeit berichten wir über die experimentelle Struktur in Lösung von Pvfp-5β, einem der Muschelproteine, die an der Oberflächenadhäsion durch Bildung der Byssus-Plaque beteiligt sind. Die Proteinsequenz enthält zwei Tandem-EGF-Module, die durch einen Linker verbunden sind. EGF-ähnliche Module sind evolutionär konservierte Motive, die durch drei konservierte Disulfidbrücken gekennzeichnet sind, die eine Struktur zusammenhalten, die ansonsten zu klein ist, um einen richtigen hydrophoben Kern zu enthalten. Aufgrund des Vorhandenseins der Disulfide sind sie normalerweise stabil gefaltet und kommen in den extrazellulären Domänen membrangebundener Proteine ​​​​und in Proteinen vor, von denen bekannt ist, dass sie sezerniert werden. Daher ist davon auszugehen, dass sie auch in Pvfp-5β zu einem strukturierten Protein führen.

Dementsprechend bestätigt unsere Arbeit diese Erwartungen und liefert weitere Erkenntnisse. Zunächst muss klargestellt werden, dass in der Literatur einige Verwirrung herrscht, wenn Pvfp-5β als Random-Coil-Protein deklariert wird, gleichzeitig aber erkannt wird, dass es EGF-ähnliche Motive enthält17,18,30. Es stimmt, dass Pvfp-5β lange unstrukturierte Schleifen aufweist, aber gleichzeitig ist es völlig falsch, EGF als ein intrinsisch unstrukturiertes Protein zu betrachten: Wie alle kleinen Module (weniger als ca. 50 Aminosäuren) benötigt es Disulfidbrücken an Ort und Stelle gehalten werden, wie es bei mehreren Neurotoxinen und bei BPTI beobachtet wird45. Dementsprechend sind die Merkmale des CD-Spektrums nicht die einer Zufallsspule, da das einzelne Minimum auf 205 nm verschoben ist (im Vergleich zu 200 nm bei Zufallsspulenproteinen) und stark dem eines anderen kleinen, aber gut strukturierten Proteinmoduls ähnelt. die WW-Domäne46, die auch mit Pvfp-5β eine positive Bande um 230 nm teilt, die wahrscheinlich durch die Stapelung aromatischer Seitenketten verursacht wird17. In Übereinstimmung mit dieser Ansicht beobachteten wir ein ganzes Netzwerk intramolekularer NOEs, was uns versicherte, dass das Protein gefaltet ist und eine robuste Struktur aufweist, selbst wenn kein geeigneter hydrophober Kern vorhanden ist. Wir haben auch schlüssige direkte Beweise dafür, dass Pvfp-5β unter sauren Bedingungen monomer ist.

Unsere Ergebnisse stehen daher im starken Widerspruch zu einer aktuellen Veröffentlichung, in der NMR-Spektren sowohl für tyrosiniertes als auch DOPAminiertes Pvfp-5β30 beschrieben werden. In dieser Arbeit zeigten die Autoren ein- und zweidimensionale Spektren, die alle Merkmale eines aggregierten, völlig unstrukturierten Proteins aufweisen. Dieselben Autoren konnten keine NOEs beobachten, die wir stattdessen ausgiebig beobachten, wie es für ein monomeres EGF-ähnliches Protein zu erwarten ist. Die Diskrepanz ist natürlich möglich, da es sich bei Pvfp-5β um ein schwer herzustellendes Protein handelt, insbesondere in Bakterien, wo es Einschlusskörper bildet, die durch ein robustes und zuverlässiges Rückfaltungsprotokoll solubilisiert werden müssen.

Unabhängig davon wurde vorgeschlagen, dass die Steifheit der Pvfp-5β-Falte erforderlich ist, um die Adhäsion und Byssusbildung zu fördern. Tatsächlich erlauben uns unsere NMR-Relaxationsparameter, wie z. B. hetNOEs, eindeutig die Aussage, dass das Rückgrat relativ starr ist und eine erhöhte Flexibilität in der ps-ns-Zeitskala nur an den Termini und in der Schleife β1/β2 beobachtet wird. Eine weitere Analyse der Spektraldichtekarten ermöglichte es uns, Reste zu identifizieren, die offenbar von der Bewegung auf der μs-ms-Zeitskala betroffen waren, wobei N39 in der langen ungeordneten Schleife zwischen β2 und β3 am stärksten betroffen ist. Es ist daher vernünftig anzunehmen, dass N39 als Scharnier zwischen den beiden EGF-Modulen fungiert. Sowohl Lysin- als auch Tyrosinreste scheinen dem Lösungsmittel ausgesetzt zu sein und können daher auch in Abwesenheit von DOPA-Modifikationen synergetisch mit Oberflächen interagieren. Die Gesamtsteifigkeit, die durch das Vorhandensein von Disulfidbrücken begünstigt wird, könnte somit ein Hauptstrukturmerkmal für die Erfüllung der Funktion sein, indem sie die dauerhafte Exposition von Tyrosin- und Lysinresten gegenüber dem Lösungsmittel begünstigt, die Wechselwirkung mit Oberflächen und/oder anderen Proteinen maximiert und gleichzeitig die Entropiestrafe.

Die Faltungs- und Restverteilung erklärt auch, warum Pvfp-5β das Frontprotein im Adhäsionsprozess in Perna viridis ist. Seine längliche Form und die Freilegung so vieler Interaktions-Hotspots sind ideal für die Haftung auf Meeressubstraten. Aufgrund der Struktur lässt sich daher leicht vorhersagen, dass sich in der Byssus-Plaque die verschiedenen Monomere anhäufen und dabei senkrecht zur Hauptachse der Fasern interagieren, wie im Kreuz-β einer Amyloidfaser (Abb. 5). Bei der Betrachtung der anderen Byssal-Plaque-Komponenten können wir vernünftigerweise davon ausgehen, dass der Komplex einen Teil des Spalts freilegt, der durch den unstrukturierten Linker zwischen den beiden EGF-Modulen gebildet wird. Dieser Spalt könnte weitere Fußproteine ​​beherbergen, die zur Faserbildung beitragen könnten.

Die längliche Form des Pvfp-5β und die Freilegung vieler Interaktions-Hotspots sind ideal für die Faserbildung. Verschiedene Einheiten könnten sich anhäufen und senkrecht zur Hauptachse der Fasern interagieren, wie im Kreuz-β einer Amyloidfaser.

Schließlich haben wir gezeigt, dass DOPA auch für LLPS nicht erforderlich ist, da wir Koazervation einfach durch Änderung des pH-Werts und der Salzkonzentration der Lösung beobachten. Das in einer früheren Studie30 beobachtete unterschiedliche Verhalten könnte wiederum durch die unterschiedliche Beschaffenheit der Proben erklärt werden. Dies steht in völliger Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen und denen anderer, die zeigen, dass DOPA für die Haftung nicht wesentlich ist17,22.

Zusammenfassend stellt unsere Arbeit einen direkten strukturellen Versuch dar, die molekulare Erkennung von Muschelproteinen auf molekularer Ebene zu verstehen und ein Modell für die Plaquebildung im Muschelbyssal bereitzustellen. Unsere Ergebnisse könnten erklären, warum DOPA für die Pvfp-5β-Koazervation wichtig sein kann, aber im Einklang mit experimentellen Erkenntnissen nicht zu den Adhäsionseigenschaften dieses Proteins beiträgt17,22. DOPA kann leicht die Packung und eine effektivere Vernetzung der Monomere im Koazervat begünstigen und zu dessen Stabilität beitragen. Zum Koazervationsprozess bei der Muscheladhäsion bleiben noch einige Fragen offen: Wir kennen beispielsweise weder die komplexe Stöchiometrie oder den relativen Beitrag der verschiedenen Komponenten noch die genaue Kinetik der möglicherweise stattfindenden Ereignisse. Wir wissen auch nicht genau, wie die Anwesenheit von DOPA den Bindungsmodus beeinflussen könnte. Daher wird weitere Arbeit erforderlich sein, um diese wichtigen offenen Fragen zu beantworten.

Klonierung, bakterielle Expression in E. coli und Reinigung wurden mit geringfügigen Anpassungen wie zuvor veröffentlicht erreicht17. Kurz gesagt, rekombinantes Pvfp-5β wurde in BL21(DE3)pLysS E. coli-Zellen als durch TEV-Protease spaltbares N-terminales His-markiertes Protein exprimiert. Die Expression wurde durch 1 mM Isopropil-β-d-1-tiogalattopiranosid für 3 Stunden bei 37 °C induziert. Die Markierung wurde durch Züchten der Zellen in Minimalmedium unter Verwendung von 15 N Ammoniumsulfat und 13 C-Glukose als einzige Stickstoff- und Kohlenstoffquellen erreicht. Die Zellen wurden durch Ultraschallhomogenisatoren aufgeschlossen. Die Einschlusskörper wurden in 8 M Harnstoff, 1 M NaCl, 2 mM DTT und 20 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,4 erneut gelöst. Der Überstand wurde über eine 5-ml-HisTrap-FF-Rohölsäule, vorgepackt mit Ni-Sepharose (GE Healthcare Life Sciences), gegeben. Das Protein wurde unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen mit einem linearen Imidazolgradienten eluiert. Die Rückfaltung wurde dann durch ausgedehnte Dialyse bei 4 °C durchgeführt, zunächst in 20 mM Natriumphosphat (pH 7,4), 2 M Harnstoff, 250 mM NaCl, 2 mM reduziertem Glutathion (GSH) und 0,5 mM oxidiertem Glutathion (GSSG), dann in derselbe Puffer ohne Harnstoff und schließlich in 20 mM Natriumphosphat bei pH 7,4 und 250 mM NaCl. Die Entfernung des His-Tags erfolgte durch Zugabe von TEV-Protease im Molverhältnis 1:50 zur Proteinlösung und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Gespaltenes Pvfp-5β wurde durch umgekehrte IMAC-Chromatographie gewonnen. Aufgrund seiner starken Adhäsionseigenschaften wurde gespaltenes Pvfp-5β nicht wie erwartet im Säulendurchfluss gesammelt, sondern mit einem Stufengradienten von Imidazol eluiert, was seine Trennung von der Markierung ermöglichte. Anschließend wurde eine umfassende Dialyse bei 4 °C in 20 mM Natriumphosphat bei pH 7,4 und 250 mM NaCl zur Entfernung von Imidazol und anschließend in 5 % Essigsäure durchgeführt, was eine einfache Lyophilisierung der Proteinprobe ermöglichte. Die Proteinreinheit wurde durch SDS-PAGE-Analyse überprüft. Die Proteinkonzentration wurde durch UV-spektrophotometrische Bestimmung bei 280 nm bestimmt (Extinktionskoeffizient [ε] = 26080 M−1 cm−1).

Dreidimensionale NMR-Messungen zur Resonanzzuordnung wurden bei 800 MHz auf Bruker-Spektrometern und 298 K durchgeführt. T1-, T2- und heteronukleare NOEs wurden sowohl bei 600 als auch 800 MHz auf Bruker-Spektrometern und 298 K unter Verwendung von Standardpulssequenzen gemessen. Zwei verschiedene Proben wurden in 20 mM Acetatpuffer pH 4,5 hergestellt, eine mit einer Konzentration von ~350 μM, die zweite mit ~900 μM. Alle NMR-Spektren wurden mit nmrPipe47 verarbeitet und mit der CCpnmr-Software48 analysiert.

15N,1H HSQC49-Peaks ermöglichten die Identifizierung der Resonanzen der Gerüstamidgruppen, die dann durch Analyse von HN(CO)CACB50-, HN(CO)CA51- und HNCA52-, HNCACB53-Experimenten den entsprechenden Aminosäuren zugeordnet wurden, was auch Werte für die chemische Verschiebung lieferte von Cα- und Cβ-Atomen, was zu einer sequenzspezifischen Zuordnung führt. Das HNCO54-Spektrum wurde verwendet, um die chemischen Verschiebungen des Carbonylkohlenstoffs zuzuordnen, während die chemischen Verschiebungswerte von Hα und Hβ durch HBHA(CO)NH55- und HBHANH56-Experimente zugeordnet wurden. HN- und N-Resonanzen von 73 von 75 Nicht-Prolin-Resten wurden zugeordnet und in der TALOS+-Software57 zusammen mit zugeordneten Resonanzen von HA, CA, CB und CO zur empirischen Vorhersage der Diederwinkel ψ und ϕ verwendet Sekundärstruktur.

Die Zuordnung der Seitenketten erfolgte durch 3D-HCCH-TOCSY58-Experimente, die einzeln für die aliphatischen und aromatischen Ketten aufgezeichnet wurden. 2D-Spektren (HB)CB(CGCD)HD59 und (HB)CB(CGCD)CEHE60 wurden verwendet, um die Hδ- und Hε-Protonen aromatischer Reste zuzuordnen. Fehlende Resonanzen wurden durch 13C NOESY-HSQC61 zugeordnet.

Die Struktur von Pvfp-5β wurde mit ARIA2.362 berechnet. Eingabedaten waren die Pvfp-5β-Aminosäuresequenz, die Liste der chemischen Verschiebungszuordnungen, die Listen der NOE-Beschränkungen, die von TALOS+ erhaltenen Diederwinkel und die von der Rosetta-Proteinmodellierungssuite63 erhaltenen Wasserstoffbrückenbindungen. Den Paaren C13–C29, C31–C40, C45–C56, C50–C67 und C69–C78 wurden gemäß früherer massenspektrometrischer Analysen ebenfalls Disulfidbrückenbeschränkungen auferlegt. Zusätzliche Strukturberechnungen wurden durchgeführt, wobei eine zusätzliche Disulfidbindung zwischen C8 und C19 eingeführt wurde, wie durch Relaxationsmessungen nahegelegt. NOE-Beschränkungen wurden manuell durch Analyse von 3D 15N NOESY-HSQC64, 3D 13C NOESY-HSQC61 mit Schwerpunkt auf der aliphatischen Region (0–6 ppm) und 3D 13C NOESY-HSQC mit Schwerpunkt auf der aromatischen Region (6–8 ppm) zugewiesen. Mehrdeutige NOE-Zuordnungen wurden von ARIA über acht Iterationen hinweg automatisch sortiert und bei jeder Iteration die besten 100 Konformeren ausgewählt. Für jede Iteration wurde ein anderer Verstoßschwellenwert festgelegt: 200,0 für it0, 6,0 für it1, 3,0 für it2, 2,0 für it3, 1,0 für it4 und it5, 0,5 für it6 bis it8. Die Konformere mit den niedrigsten Energiewerten wurden verwendet, um die Abstandsbeschränkungen aus falsch positiven Ergebnissen herauszufiltern und Mehrdeutigkeiten zuzuordnen. ARIA-Berechnungen wurden mit der adaptiven Wahl der Verletzungstoleranz durchgeführt. Die Zuordnungstoleranz der NOESY-Peaklistenfrequenzen betrug 0,02 ppm für 1H und 0,4 ppm für 15N- und 13C-Kerne. Für die Paare T18-Y30, K20-K28, T55-S68 und G57-Y66 wurden Wasserstoffbindungsbeschränkungen auferlegt. Es wurde ein logarithmisch-harmonisches Distanzbeschränkungspotential angenommen. Dieses Potenzial ergibt sich aus einer Bayes'schen Analyse, die zeigt, dass NOEs und die abgeleiteten Abstände idealerweise der logarithmischen Normalverteilung folgen65,66. Während der zweiten Abkühlstufe des simulierten Glühens und während der Wasserveredelung wurde ein logarithmisch-harmonisches Potential angelegt. Das Strukturensemble wurde mit Chimera und Pymol67,68 visualisiert und analysiert. Die Qualitätsvalidierung wurde mit PROCHECK69 und der Protein Structure Validation Software Suite (PSVS, https://www.bio.tools/psvs#!) durchgeführt.

Die Temperaturkoeffizienten der chemischen Verschiebung von Amid-1HN von Pvfp-5β wurden durch die Aufzeichnung einer Reihe zweidimensionaler 15N,1H-HSQC-Spektren bei 283, 288, 293, 298 und 303 K unter Verwendung eines Bruker-Spektrometers bestimmt, das mit einer Protonenfrequenz von 800,03 MHz arbeitet. Alle Spektren wurden auf das Wassersignal für jede Temperatur bezogen, mit nmrPipe47 verarbeitet und mit der CCpnmr-Software48 analysiert. Die chemische Verschiebung des Wassers wurde auf 3-(Trimethylsilyl)propan-1-sulfonsäure (DSS) bezogen, die eine vernachlässigbare Temperaturabhängigkeit aufweist und eine durch Deuterium-Lock-Artefakte unbeeinflusste Analyse ermöglicht. Die chemischen Verschiebungswerte δHN aller Rückstände wurden als Funktion der Temperatur aufgetragen. Die Daten wurden unter der Annahme analysiert, dass Reste mit dδHN/dT < –5 ppb/K schwächere H-Bindungen bilden und als Bruchpunkte der Sekundärstruktur oder, wenn sie sich in einer unstrukturierten Region befinden, als Promotoren von H-Bindungen mit Wasser betrachtet werden sollten. Werte von dδHN/dT > –5 ppb/K entsprechen der Bildung festerer Bindungen, die wahrscheinlich an Sekundärstrukturelementen beteiligt sind70.

Die Rückgratdynamik von Pvfp-5β wurde bei 298 K mit der 15N-R1-, 15N-R2-Relaxation und dem {1H}–15N heteronuklearen nuklearen Overhauser-Effekt (hetNOE)71,72,73,74 unter zwei verschiedenen Magnetfeldern (14.1 und 18.8) untersucht T). 15N-R1, 15N-R2 und {1H}–15N NOE wurden auch bei anderen drei Temperaturen (288, 293 und 303 K) unter dem alleinigen Magnetfeld von 18,8 T gemessen. In allen Fällen wurden R1 und R2 mit Verzögerungen gemessen variierend von 0,01 bis 2 s bzw. zwischen 0,017 und 2,7 s. {1H}-15N-NOE-Daten im stationären Zustand wurden durch Messung von zwei Spektren erhalten: einem anfänglichen Spektrum, das ohne die anfängliche Protonensättigung aufgezeichnet wurde, und einem zweiten Spektrum, das mit einer anfänglichen Protonensättigung von 8 s aufgezeichnet wurde. Aus den Verhältnissen der durchschnittlichen Intensitäten der Peaks mit und ohne Protonensättigung wurden dann die NOE-Werte ermittelt.

Die bei 298 K erfassten Relaxationsdaten, die sowohl bei 18,8 T- als auch bei 14,1 T-Magnetfeldern erhalten wurden, wurden mit dem standardmäßigen mathematischen modellfreien Formalismus75 analysiert, der im Dynamic Center-Tool der Bruker-Topspin-Plattform verfügbar ist. Die experimentellen Daten wurden unter Verwendung zweier verschiedener Strukturen mit 5 und 6 Disulfidbrücken verarbeitet und angepasst. Eine weitere Analyse der bei verschiedenen Temperaturen erfassten Relaxationsdaten wurde unter Verwendung des Spektraldichtefunktionsansatzes31,32 durchgeführt. Die Temperatur wurde durch Überwachung der chemischen Verschiebungsänderungen ausgewählter Peaks überprüft. Durch die Anwendung von Hochfrequenzimpulsen wurde keine Probenüberhitzung beobachtet. Von den 83 vorhandenen Aminosäuren wurden fünfzehn Reste von der Analyse ausgeschlossen, entweder weil sie Proline waren oder weil sie im 15N HSQC überlappten (P5, P7, P10, Y11, P12, C13, G37, A44, P47, P49, Y58). , Y60, P63, P70, G75).

Strukturmodelle von Pvfp-5β wurden mit der RoseTTafold-Suite76 erstellt. Dies ist eines der Rechenwerkzeuge, die auf einem Deep-Learning-Netzwerk basieren und in der Lage sind, die Proteinstruktur anhand ihrer Aminosäuresequenz vorherzusagen. Das Deep-Learning-Netzwerk ist in der Lage, eine Reihe von 1D-, 2D- und 3D-Faltungsoperationen durchzuführen, um die Genauigkeit des resultierenden Proteinstrukturmodells zu erhöhen. Die Kombinationen aus mehreren Sequenzausrichtungen, Distanzkarten und dreidimensionalen Koordinatendarstellungen führen zu besseren Strukturmodellen im Vergleich zu den traditionelleren Vorhersagemethoden, die auf mehreren Sequenzausrichtungen und Kontaktkarten basieren. Die Software generierte fünf Modelle, deren Unterschiede als Angström-Fehlerschätzungen gegenüber der Position jedes Rests in der Sequenz hervorgehoben werden. Die Güte der Vorhersage wird durch ein Konfidenzniveau definiert, das mit dem in DeepAccNet77 vorhergesagten lDDT (lokaler Distanzdifferenztest) zusammenhängt. Für Pvfp-5β haben wir ein Konfidenzniveau von 0,92 erhalten.

Lyophilisiertes Pvfp-5β wurde in 10 mM Essigsäure bis zu einer Endkonzentration von 10 mg/ml gelöst. Die Lösung wurde dann auf 1 mg/ml in 20 mM Natriumacetat bei pH 4,5 oder 0,1 M Tris-HCl bei pH 8 und 1 M NaCl verdünnt und mit 40 µM einer wässrigen ThT-Lösung angefärbt. 250 Mikroliter gefärbter Proben wurden auf Objektträger mit Mikroskopkammer gelegt und mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica TCS SP5 und einem 63-fachen Ölobjektiv (Leica Microsystems, Deutschland) mit einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixel abgebildet. Der Leica-Weißlichtlaser war auf eine Anregung von 470 nm eingestellt und die ThT-Emission wurde im Bereich von 485–585 nm nachgewiesen.

FLIM-Daten wurden im Zeitbereich mit einem eigenständigen TCSPC-Modul picoHarp 300 (Picoquant) unter Verwendung eines 63-fachen Ölobjektivs (Leica Microsystems) erfasst. Bilder mit 256 × 256 Pixeln wurden bei einer Scanfrequenz von 200 Hz aufgenommen, wobei der Leica-Weißlichtlaser so eingestellt war, dass ThT angeregt wurde (λex: 470 nm, λem: 485–585 nm). Die FLIM-Kalibrierung des Systems wurde durch Messung der bekannten Lebensdauer von Fluorescein durchgeführt, die einer einzelnen Lebensdauer von 4,0 ns entspricht. FLIM-Daten wurden mit dem Phasor-Ansatz42,43 von der SimFCS-Software analysiert, die am Laboratory of Fluoreszenzdynamik der University of California in Irvine entwickelt wurde (www.lfd.uci.edu). Der Phasor-Ansatz ist eine Fourier-Domänentechnik, die eine grafische Analyse von FLIM-Messungen ermöglicht. Es transformiert den in jedem Pixel des Bildes gemessenen Fluoreszenzabfall in einen einzelnen Punkt, der als „Zeiger“ bezeichnet wird, in einer polaren Darstellung. Alle möglichen einfach exponentiellen Zerfälle liegen auf einem Halbkreis (definiert als universeller Kreis) mit Radius 1/2, der vom Punkt (0, 0), entsprechend τ = ∞, zum Punkt (1, 0), entsprechend τ =, verläuft 0. Komplexe Zerfälle sind lineare Kombinationen einzelner Exponentiale und werden innerhalb des Halbkreises dargestellt. Da die Zeiger der Vektoralgebra folgen, ist es möglich, die Anteile zweier fluoreszierender Spezies (im einfachsten Fall) durch die Hebelregel der Vektoradditionen geometrisch aufzulösen. Die lineare Kombination zweier einfach-exponentieller Zerfallskomponenten erzeugt Zeiger innerhalb des Universalkreises, die auf einer geraden Linie liegen, die die Zeiger der beiden Einzelkomponenten verbindet. Der Beitrag/Anteil einer einzelnen Komponente zur Lebensdauer ist proportional zum Abstand des Zeigers von ihr.

Für Pvfp-5β-Messungen wurden die Lebensdauerverteilungen mit einem grünen, cyanfarbenen und roten Cursor ausgewählt und entsprechende Pixel mit demselben Farbcode in den Bildern lokalisiert. Grüne Pixel stehen im Zusammenhang mit einer kürzeren Lebensdauer. Die zunehmend zunehmenden Lebensdauern werden in den Farben Cyan und Rot abgebildet.

Docking-Berechnungen der Protein-Protein-Wechselwirkungen für den Pvfp-5β/Pvfp-5β-Komplex wurden von Anfang an unter Verwendung der integrativen Modellierungsplattform HADDOCK2.478,79 durchgeführt. Während des HADDOCK-Docking-Protokolls werden die interagierenden Partner in der Anfangsphase als starre Körper behandelt, während die zweite Phase den interagierenden Partnern durch eine dreistufige, auf Molekulardynamik basierende Verfeinerung Flexibilität verleiht, um die Grenzflächenpackung zu optimieren. Reste, die zur Grenzflächenregion gehören, dürfen dann in einem zweiten Verfeinerungsschritt ihre Seitenketten verschieben. Anschließend wird eine abschließende Verfeinerung in einer Lösungsmittelhülle durchgeführt, um die Energie der Wechselwirkung zu verbessern. Die resultierenden Protein-Protein-Komplexe werden anhand des HADDOCK-Scores eingestuft, der eine gewichtete Summe mehrerer Begriffe wie elektrostatische Energie, Van-der-Waals-Energie, Abstandsbeschränkungsenergie und vergrabene Oberfläche darstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die NMR-Aufgabe wurde der BioMagResBank (BMRB: www.bmrb.wisc.edu, https://doi.org/10.1093/nar/gkm957) unter der Zugangsnummer 51091 übermittelt. Die NMR-Strukturkoordinaten wurden in den Proteindaten hinterlegt Bank (PDB: www.rcsb.org, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7000-1_26) unter dem Zugangscode 7QAB. Alle weiteren Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Arbeit bei der Fondazione Ri.MED wurde von Patto per il Sud Regione Siciliana – Grant „CheMISt“ (CUP G77B17000110001) und PO FESR Sicilia 2014/2020 Azione 1.5.1 – Grant „Potenziamento Infrastruttura di Ricerca“ unterstützt. GMP-Einrichtung, Laboratori di Ricerca e Servizi Diagnostici e Terapeutici IRCCS-ISMETT“ (CUP G76G17000130007), Partnerschaft IRCCS-ISMETT/Fondazione Ri.MED. AP wurde vom Francis Crick Institute durch die Bereitstellung des Zugangs zum MRC Biomedical NMR Centre unterstützt. Das Francis Crick Institute erhält seine Kernfinanzierung von Cancer Research UK (FC001029), dem UK Medical Research Council (FC001029) und dem Wellcome Trust (FC001029). Wir möchten dem ATeN Centre der Universität Palermo für die Infrastrukturunterstützung danken. Wir danken auch Nadia Consiglio für ihre Unterstützung freundliche Hilfe bei der Umsetzung von Abb. 5.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Maria Agnese Morando, Francesca Venturella.

Abteilung für Strukturbiologie und Biophysik, Fondazione Ri.MED, 90133, Palermo, Italien

Maria Agnese Morando, Francesca Venturella, Martina Sollazzo, Elisa Monaca, Raffaele Sabbatella und Caterina Alfano

Abteilung für biologische, chemische und pharmazeutische Wissenschaften und Technologien (STEBICEF), Universität Palermo, 90128, Palermo, Italien

Martina Sollazzo

Fachbereich Physik und Chemie – Emilio Segrè (DiFC), Universität Palermo, 90128, Palermo, Italien

Valeria Vetri

Institut für Biophysik, Nationaler Forschungsrat, 90143, Palermo, Italien

Rosa Passantino

Europäische Synchrotronstrahlungsanlage, Ave des Martyrs, 38000, Grenoble, Frankreich

Annalisa Shepherd

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CA- und AP-Konzeptualisierung; Vorbereitung von FV-, EM-, RS- und RP-Proben; CA-, MAM- und MS-Datenerfassung; MAM-, FV-, MS-, VVAP- und CA-Datenanalyse; Kuratierung von AP- und CA-Daten; AP und CA haben das Manuskript geschrieben; CA-Überwachung, Ressourcen und Finanzierungsbeschaffung.

Korrespondenz mit Caterina Alfano.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Dieses Manuskript wurde zuvor in einer anderen Nature Portfolio-Zeitschrift rezensiert. Das Manuskript wurde ohne weitere Begutachtung bei Communications Biology als zur Veröffentlichung geeignet erachtet. Hauptredakteur: Gene Chong.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Morando, MA, Venturella, F., Sollazzo, M. et al. Lösungsstruktur von rekombinantem Pvfp-5β gibt Einblicke in die Muscheladhäsion. Commun Biol 5, 739 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03699-w

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Eingegangen: 02. Februar 2022

Angenommen: 11. Juli 2022

Veröffentlicht: 25. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03699-w

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